Karam, Cristelle
(2016).
« Expression et purification de la protéine P97c de Mycoplasma hyopneumoniae : une molécule potentiellement adjuvante » Mémoire.
Montréal (Québec, Canada), Université du Québec à Montréal, Maîtrise en biologie.
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Résumé
Les adjuvants sont des composés qui peuvent augmenter et/ou moduler la réponse immunologique contre une molécule immunogène. La protéine P97 de Mycoplasma hyopneumoniae a été caractérisée comme étant une protéine assurant l'adhésion de cet organisme aux cellules ciliées des voies respiratoires chez le porc favorisant le développement de la pneumonie enzootique. Des études précédentes ont montré que la portion C-terminale de la P97 (P97c), lorsque couplée à d'autres protéines immunogènes et délivrée in vivo avec des adénovecteurs, augmente la réponse en anticorps contre ces immunogènes, ce qui suggère un effet adjuvant de la P97c. La protéine recombinante P97c a été produite afin de déterminer son rôle potentiellement adjuvant. Dans cette optique, le gène codant la P97c a été cloné dans le vecteur pET-21b (+). L'expression de la protéine a été réalisée dans des bactéries Rosetta Garni transformées par le vecteur pET-21b (+) et les conditions optimales de culture pour l'expression ont été déterminées. Peu importe les conditions utilisées, l'expression de la protéine générait de nombreuses formes tronquées de la P97c. La séquence codant la P97c a été alors clonée dans le vecteur pET-22b (+), permettant d'introduire une séquence d'exportation vers le périplasme. L'expression de la P97c a été réalisée dans les bactéries BL21 DE3 transformées par le vecteur pET-22b (+) tout en déterminant les conditions optimales de culture pour l'expression. Les résultats ont démontré que deux formes de la P97c (la complète et une tronquée) ont été retrouvées dans la fraction périplasmique des bactéries induites. Suite à leur purification, les deux formes de la protéine ont pu être séparées par chromatographie d'exclusion stérique, ce qui a permis d'obtenir la P97c recombinante entière seule et en quantité suffisante pour des études de caractérisation de l'activité biologique in vitro et ultérieurement in vivo. Ces deux formes ont été analysées par un test de dichroïsme circulaire qui a montré une structure désordonnée pour la forme complète et une structure partiellement hélicoïdale pour la protéine tronquée. L'activité biologique de P97c a été déterminée en exposant des cellules dendritiques de souris C57BL/6 à différentes doses de la protéine. Puis un test d'ELISA a été effectué pour la mesure des cytokines. Le niveau de l'Interleukine-6 (IL-6) a augmenté graduellement avec l'augmentation de la concentration de la P97c en présence et en absence de polymyxine B. Le Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) a été aussi détecté par la stimulation des cellules dendritiques avec la P97c en présence et en absence de polymyxine B.
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MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Mycoplasma hyopneumoniae, P97c, Vaccin, Adjuvant, Expression, Chromatographie d'exclusion stérique, Dichroïsme circulaire.
| Type: |
Mémoire accepté
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| Informations complémentaires: |
Le mémoire a été numérisé tel que transmis par l'auteur. |
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Directeur de thèse: |
Archambault, Denis |
| Mots-clés ou Sujets: |
Mycoplasma hyopneumoniæ / Protéine P97c / Adhésines / Adjuvants immunologiques / Vaccins / Expression génique / Protéines -- Purification / Escherichia coli / Chromatographie sur gel / Dichroïsme circulaire |
| Unité d'appartenance: |
Faculté des sciences > Département des sciences biologiques |
| Déposé par: |
Service des bibliothèques
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| Date de dépôt: |
26 janv. 2017 19:16 |
| Dernière modification: |
26 janv. 2017 19:16 |
| Adresse URL : |
http://archipel.uqam.ca/id/eprint/9285 |
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