Développement et caractérisation d'un anticorps à chaîne unique pour la ligase E3 de l'ubiquitine RNF167

Grau, Marylou (2025). « Développement et caractérisation d'un anticorps à chaîne unique pour la ligase E3 de l'ubiquitine RNF167 » Mémoire. Montréal (Québec), Université du Québec à Montréal, Maîtrise en biochimie.

Fichier(s) associé(s) à ce document :

Prévisualisation	PDF Télécharger (8MB)

Résumé

RNF167, une ligase E3 de l’ubiquitine, demeure peu étudiée malgré son implication potentielle dans divers processus physiologiques d’intérêt tels que le routage intracellulaire. Ce projet vise à développer un outil à base de nanocorps (VHH) pour détecter et suivre RNF167 en contexte cellulaire par microscopie d’immunofluorescence. Le nanocorps (RNF167-A5), initialement présenté dans l’article de Siepe et al. (2023) comme outil de ciblage multivalent, a été détourné de son utilisation primaire et modifié pour générer plusieurs versions recombinantes monovalentes fusionnées à des fluorophores ou une étiquette d’affinité. Des tests d’interaction de liaison in vitro de type GST pull-down ont confirmé la spécificité des nanocorps GST-VHH produits en Escherichia coli envers RNF167. La spécificité du nanocorps marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) a également été confirmée in vitro. Cependant, aucun essai n’a permis de valider la spécificité des VHH fusionnés en C-terminal avec des protéines fluorescentes, ce qui suggère que la fusion à EGFP ou à mCherry a vraisemblablement perturbé leur fonction. La reconnaissance de RNF167 en microscopie dépendait du contexte d’accessibilité dans les cellules HEK293T. Aucun signal n’a été observé en cellules vivantes, dans un contexte natif ou de surexpression, mais uniquement après perméabilisation, ce qui a empêché l’étude du trafic cellulaire de RNF167 par endocytose des VHH. L’analyse des signaux de fluorescence obtenue en conditions de surexpression de RNF167 sur des cellules perméabilisées était corrélée à une augmentation du signal de GST-VHH, suggérant une certaine spécificité fonctionnelle. Cependant, la répression génique de RNF167 par un petit ARN interférant n’a pas diminué de manière significative le signal de GST-VHH. Ce travail représente une étape préliminaire importante dans le développement d’un outil spécifique pour l’étude fondamentale de la ligase RNF167 et souligne les défis liés à l’utilisation des VHH en imagerie. Il ouvre de nouvelles perspectives et pourrait offrir un modèle applicable à l’étude d’autres ligases E3. _____________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Ligase E3 RNF167, anticorps à domaine unique (VHH), protéine recombinante, microscopie d’immunofluorescence

Type:	Mémoire accepté
Informations complémentaires:	Fichier numérique reçu et enrichi en format PDF/A.
Directeur de thèse:	Lussier, Marc
Mots-clés ou Sujets:	Ligases E3 de l'ubiquitine / Anticorps à domaine unique / Protéines recombinantes / Microscopie d’immunofluorescence
Unité d'appartenance:	Faculté des sciences > Département de chimie Faculté des sciences > Département des sciences biologiques
Déposé par:	Service des bibliothèques
Date de dépôt:	08 janv. 2026 14:20
Dernière modification:	06 mars 2026 12:05
Adresse URL :	https://archipel.uqam.ca/secure/id/eprint/19486

Modifier les métadonnées (propriétaire du document)

Statistiques