Kieto Suka Vita, Isaac Vita (2023). « Développement d'une méthode d'isolation de la membrane externe bactérienne en utilisant la cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen » Mémoire. Montréal (Québec), Université du Québec à Montréal, Maîtrise en biochimie.
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Résumé
Chez les bactéries, la surface cellulaire joue un rôle crucial. En effet, c’est la partie de la cellule qui interagit le plus avec l’environnement externe. Cette surface est tapissée de nombreux composants indispensables tels que des molécules de lipopolysaccharide (LPS) et des protéines. Les molécules de LPS se situent dans le feuillet externe de la membrane externe (ME) et gèrent des interactions importantes avec d'autres organismes dans les communautés et au niveau de la cellule. Ils jouent un rôle crucial dans l’intégrité structurelle de la bactérie, dans la communication entre cellules et dans la pathogenèse. Ce sont notamment l’extraction des molécules de LPS que nous ciblons dans notre étude comme elles l’ont déjà été auparavant (Dumont et al., 2012). Cependant, le recours aux molécules de LPS lors de techniques de purification protéique n’est pas d’une efficacité sans faille. Dans cette recherche, nous avons opté pour une bactérie à Gram négatif, donc possédant une membrane double où le sucre attaché au lipide A du LPS est l’acide 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo). Dans les techniques standard de purification protéique, il y a fréquemment de la contamination de la fraction ME, par exemple du fait de la mauvaise séparation des deux membranes ou alors du fait d’une isolation non représentative de toute la membrane. C’est dans cette optique qu’en utilisant une espèce bactérienne modèle (Myxococcus xanthus), une méthode d’extraction de la ME en utilisant la labellisation métabolique du lipopolysaccharide (LPS) a été développée impliquant une réaction de cycloaddition entre dibenzocyclooctyne (DBCO) dit « click » présent sur la surface des billes magnétiques et une molécule de 8-N3-Kdo intégré dans la molécule de LPS. Plusieurs paramètres (température d’incubation, nombre de lavages, ordre des étapes d’extraction) ont été évalués afin d’optimiser la méthode d’extraction. Mais c’est entre autres les gels SDS-PAGE montrant la présence de la mCherry fusionnée a une protéine qui ont permis de montrer que l’extraction de la ME sur la souche DZ2 OMss-mCherry fonctionne partiellement, en effet la majorité des gels montrent une absence du signal protéique. Une seconde souche AgmU-mCherry où le mCherry est associé avec le côté périplasmique de la ME vient cependant confirmer que le protocole d’extraction développé est exclusif à la ME. Néanmoins, les résultats des SDS-PAGE montrent une non-spécificité des billes magnétiques associées au DBCO, il y a extraction avec et sans 8-N3-Kdo. Il en va sans dire que le caractère agrégatif provoqué par les pili et l’exopolysacharide d’une souche modifiée DZ2 OMss-mCherry perturbe l’extraction et donc l’efficacité de cette nouvelle méthode. De plus, les résultats des tests d’agrégation et de marquage avec le trypan bleu montrent que l’incorporation du 8-N3- Kdo aux souches contribue de façon quantitative au rehaussement de cette agrégation et influence la motilité sociale des bactéries. Par ailleurs, différents paramètres sont testés et modifiés à travers ce document afin d’optimiser le rendement protéique après extraction. L’extraction membranaire nous amènerait à étudier le protéome de cette membrane externe. _____________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo), Lipopolysaccharide, Membrane externe, Myxococcus xanthus, Protéines, Purification
| Type: | Mémoire accepté |
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| Informations complémentaires: | Fichier numérique reçu et enrichi en format PDF/A. |
| Directeur de thèse: | Islam, Salim Timo |
| Mots-clés ou Sujets: | Protéines de membrane externe / Purification des protéines / Lipopolysaccharides bactériens / Membrane bactérienne externe / Myxococcus xanthus / Acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique |
| Unité d'appartenance: | Faculté des sciences > Département de chimie Faculté des sciences > Département des sciences biologiques |
| Déposé par: | Service des bibliothèques |
| Date de dépôt: | 20 oct. 2023 08:15 |
| Dernière modification: | 20 oct. 2023 08:15 |
| Adresse URL : | http://archipel.uqam.ca/id/eprint/17073 |
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