Ghilarducci, Kim (2019). « Caractérisation fonctionnelle de l'interaction entre l'ubiquitine E3 ligase RNF167 et des enzymes conjugatrices de l'ubiquitine » Mémoire. Montréal (Québec, Canada), Université du Québec à Montréal, Maîtrise en biochimie.
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Résumé
L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle médiée par une cascade enzymatique impliquant une enzyme activatrice de l'ubiquitine (UBE1), une enzyme conjugatrice de l'ubiquitine (UBE2) et une enzyme ligase (UBE3). Cette modification permet, par l'ajout d'une ou de plusieurs ubiquitines sur un substrat, de moduler l'activité ou le niveau d'expression des protéines dans la cellule. Dans le cadre de ce projet de recherche, l'étude porte sur RNF167, une UBE3 membranaire à domaine RING (domaine de liaison aux UBE2s). Cette enzyme, au niveau des neurones, joue un rôle dans la régulation négative de l'expression de récepteur du glutamate, les récepteurs AMPAs (AMPAR), jouant un rôle au niveau de l'apprentissage et de la mémoire. L'ubiquitination de ceux-ci lors de leur endocytose, mène à leur dégradation au niveau des lysosomes. Le but de cette recherche est de caractériser l'interaction entre l'UBE3 ligase RNF167 et les enzymes conjugatrice de l'ubiquitine. Pour se faire, la purification d'une forme recombinante de RNF167 a été développée. Cette purification de la protéine a été possible lorsqu'une étiquette HA a été fusionnée à l'extrémité N-terminale de RNF167 et une étiquette 6xHis fusionnée à l'extrémité C-terminale. Une fois que la protéine ait été purifiée, un essai d'ubiquitination in vitro a permis de déterminer que RNF167 peut se lier de façon fonctionnelle avec une dizaine d'UBE2. Parmi les UBE2s qui ont réagi de façon fonctionnelle avec RNF167, seul UBE2N, aidée de ses cofacteurs, UBE2V1 ou UBE2V2, peut former une chaîne d'ubiquitine K63. Ce type de chaîne représente la forme d'ubiquitination des AMPARs. C'est pour cette raison que l'étude s'est concentrée sur l'interaction entre RNF167 et UBE2N. Des essais d'interaction in vitro par GST pull-down ont confirmé l'interaction entre les deux protéines. Des essais biophysique de résonance des plasmons de surface Spratt et al. (2014) montrent que l'association et la dissociation du complexe est très rapide, ce qui représente une interaction transitoire et qui est conforme à une interaction entre une UBE2 et une UBE3 en milieu physiologique. Des essais d'immunofluorescence chez les cellules HEK293 montrent que les deux protéines se retrouvent dans le même espace cellulaire. Finalement, des fractionnements cellulaires d'un cortex de souris indiquent que RNF167, UBE2N, UBE2V1 et UBE2V2 se retrouvent dans les mêmes compartiments cellulaires. En conclusion, cette étude a permis de démontrer l'interaction entre RNF167 et UBE2N et rend intéressante l'étude d'UBE2N pour l'ubiquitination des AMPARs. _____________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : purification de protéines, interaction protéine-protéine, ubiquitination, RNF167, UBE2
| Type: | Mémoire accepté |
|---|---|
| Informations complémentaires: | Le mémoire a été numérisé tel que transmis par l'auteur. |
| Directeur de thèse: | Lussier, Marc |
| Mots-clés ou Sujets: | Ubiquitine / Ubiquitination / Purification des protéines / Interactions protéine-protéine |
| Unité d'appartenance: | Faculté des sciences > Département de chimie Faculté des sciences > Département des sciences biologiques |
| Déposé par: | Service des bibliothèques |
| Date de dépôt: | 25 sept. 2019 15:19 |
| Dernière modification: | 25 sept. 2019 15:19 |
| Adresse URL : | http://archipel.uqam.ca/id/eprint/12796 |
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